高通量测序技术在土壤微生物多样性研究中的研究进展

2016-11-09 楼骏等 农业环境科学

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为了阐明高通量测序技术在土壤微生物多样性研究中的应用前景，归纳介绍了Solexa、454 和Ion Torrent 等常用高通量测序技术的原理和优点，综述了近年高通量测序技术在土壤微生物物种多样性、结构多样性、功能多样性和遗传多样性四个方面应用的研究进展，总结了高通量测序技术应用中存在的问题，并分析展望了其在土壤微生物多样性研究中的发展趋势。

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0 引言

据估计，全球土壤中微生物的种类可达数万种，而数量更可达10²⁹数量级。这些土壤微生物对生物圈C、N、P、S、无机金属离子的生物地球化学循环和各类有机物的分解转化过程中起着重要作用，以往土壤微生物领域的研究主要集中在物种多样性、结构多样性、功能多样性和遗传多样性等四方面的工作。虽然出现了诸如高通量培养技术、土壤基质膜培养和细胞微囊包埋技术等新的微生物培养技术，但是土壤中微生物的可培养率仍然只有0.1%到1%。因此，非培养研究土壤微生物的方法，如研究结构多样性的DNA指纹图谱技术、磷脂脂肪酸分析法等，以及研究结构和功能多样性的微阵列基因芯片等应运而生，这些方法克服了培养技术的一些缺点，获得了一部分不能分离培养的土壤微生物信息。但是这些方法相比较近年发展起来的第二代测序方法(NGS)而言，有通量低和信息量小的缺点。第二代测序方法以Illumina公司的Solexa、Roche公司的454和LifeTechnologies公司的SOLiD、Ion Torrent为主。这些测序平台最大的特点是数据产出通量高，在土壤微生物物种、结构、功能和遗传多样性的研究中可以获得丰富的信息。本研究旨在简单介绍第二代高通量技术，并在此基础上综述了该技术在土壤微生物研究中的应用。

1. 高通量测序技术简介

1.1 Illumina Solexa 测序法
Illmina 公司包含有HiSeq和MiSeq测序平台，基于Solexa技术，其基本原理是单分子簇边合成边测序(Sequencing by Synthesis，SBS)和dNTP可逆终止化学反应。该方法将打断成小片段的DNA接上接头后连接到固相表面，通过桥式PCR将这些小片段的单分子DNA扩增成上千拷贝的单分子簇(cluster)。在扩增达到测序反应所需的信号强度模板量之后，向反应体系添加带有特异荧光的碱基(dNTP)，这些dNTP由于3’羟基被化学基团保护，因此每次反应只能添加1个dNTP。洗去本次反应添加物后，激发dNTP上的不同颜色的荧光基团，记录荧光信号、转化并得到反应结果。通过dNTP可逆终止的特性，依次添加各种dNTP，最终完成对DNA的测序。
该测序方法的主要优点是通量高、准确率高以及成本低等。Illumina HiSeq 2000在一个运行周期11天的时间里可以产出600G的数据，而2012年初，HiSeq 2000的升级版HiSeq 2500在27h的运行周期里可以获得人类基因组40倍覆盖率的数据量。HiSeq和MiSeq测序平台的错误率很低，分别在0.26%和0.80%，尤其是在连续碱基测序的准确率很高。MiSeq读长已经可达2×250 bp双向测序(PE)，并且有望可以达到2×400 bp PE，而测序成本只为传统Sanger测序技术的1%。同时由于Solexa双向测序的特点，在构建基因组PE文库时，插入片段大小可长至10 kb文库，这更扩展了其在基因组中的应用。

1.2 Roche 454 GS FLX+ System
相比Illumina公司，Roche 早一年在2005年发布454测序平台，454测序平台是第一个商业运营的第二代高通量测序平台。454测序主要利用DNA乳胶扩增系统和皮升体积的焦磷酸为基础的测序方法，其主要原理是：一个特别设计的DNA捕获磁珠，与独特的短DNA片段结合，并用扩增试剂使之乳化，形成包含有一个磁珠和一个独特DNA片段的微反应体系，确保每个反应体系都是DNA单拷贝。DNA片段在各自反应体系中发生扩增反应之后，打破乳化体系，将携带有PCR 产物的磁珠随后放入只能容纳单个磁珠的Pico Titer Plate (PTP)板中开始测序。A、T、C、G 4种碱基依次进入PTP 板，如果发生碱基配对就会释放一个焦磷酸，焦磷酸在ATP硫酸化酶和荧光素酶的作用下发出光信号。通过对光信号的捕获、转化和记录，获得待测DNA的碱基序列。
该测序方法的主要特点是通量高、读长长和速度快等。在一个运行周期10h的时间里，可以获得100万条序列，比传统Sanger测序法快100倍。10h的运行可以获得平均读长达450bp，而在23h一个运行周期的运行中最长读长可达到1000 bp，该测序长度是所有第二代高通量测序中与Sanger测序法最接近的。另外454 GS Junior的错误率仅为0.38%。

1.3 Life Technologies Ion Torrent
Life Technologies公司利用半导体芯片技术设计了Ion Torrent PGM (Personal Genome Machine)和IonProton。该测序平台主要检测DNA聚合酶链式反应中释放的质子(H⁺ )。其主要原理是每合成一个dNTP便会产生相同摩尔数的焦磷酸盐(pyrophosphate，PPi)，在PPi水解的同时产生质子(H⁺)，即H⁺的变化与参与反应的dNTP 相关，通过芯片检测DNA 聚合过程中产生的H⁺，完成DNA 序列的测定。Ion Torrent 测序平台的核心是一块半导体芯片，每次反应限制单一dNTPs 加入：每次按顺序加入4 种非修饰核苷酸中的一个，检测加入的dNTP 与模板互补发生反应后释放的H⁺，通过H⁺的检测完成DNA的测序。
该方法的最主要特点是成本低。Ion Proton 测序平台只需$500即可完成人类基因组外显子的测序，同时在未来Proton Ⅱ有望将此费用降到$150，甚至完成全基因组测序也只需$1000。Ion Torrent PGM测序平台现在可以实现2×200 bp PE，其错误率为1.71%。

2. 高通量测序技术在土壤微生物研究中的应用

2.1 土壤微生物物种和结构多样性的研究
通过高通量测序技术检测土壤中微生物细胞内特定遗传物质（原核微生物16s rDNA/rRNA，真核微生物18s rDNA/rRNA或rDNA-ITS）。这些特定的遗传物质都具有一定的进化保守性，保守区序列为所有同类微生物所共有，在保守序列之间存在由于进化造成的物种之间序列差异的可变区域。因此，通过对这些序列可变区域的测定和比对，探究并揭示土壤中微生物物种和群落结构的多样性。
Roesch等在罗氏GS FLX平台上使用454焦磷酸测序法实现了对土壤微生物多样性的研究，该研究发现农业管理方法对土壤中细菌和古菌的多样性有重大的影响作用：门水平下，森林土壤细菌要比农业土壤丰富，但种水平下，农业土壤细菌更为丰富；而森林土壤古菌的丰富度也低于农业土壤。除此之外，Buee等运用454高通量测序法研究了森林土壤真菌结构多样性，结果表明土壤真菌的数量和多样性远远多于先前的假设，其中少数真菌种类占据了土壤真菌数量的大部分。随着高通量测序的出现，也实现了大尺度空间上土壤微生物物种和结构多样性的研究。在2009年，Lauber等首次使用高通量测序法对美国从北到南88个土壤样品的细菌物种和结构多样性进行了研究，并发现不同土壤细菌群落结构多样性及细菌群落结构系统发育多样性与土壤pH之间存在显著的相关性，相关系数分别达到0.79和0.71。Chu 等和Tripathi等分别在北极圈和热带土壤微生物群落结构的研究中，亦通过高通量测序证实了土壤pH值可以预测土壤微生物群落结构。
因此，高通量测序在土壤微生物物种和结构多样性研究中可获得更多的信息，使研究者更为深入的探明土壤微生物群落结构多样性。

2.2 土壤微生物功能多样性的研究
mRNA作为产生蛋白质和活性酶的中间产物，具有与相对应DNA互补配对的序列。因此通过对土壤微生物转录组mRNAs的高通量测序，可以了解土壤微生物活性以及土壤微生物间的调控作用，探究土壤中微生物功能多样性。
Damon等通过宏转录组研究山毛榉和云杉森林的土壤真菌功能基因表达多样性并发现了与氮（包括氨、氨基酸和寡肽）、糖、磷酸盐和硫酸盐等土壤养分利用有关的酶基因，这些酶基因参与了129条KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路，其中0.5%~0.8%的酶基因与降解植物细胞壁高聚物组成成分（如纤维素、果胶和木质素等）相关；除此已知的基因之外，森林土壤中依然有高达60%的功能基因在GenBank/EMBL/DDJB 蛋白质数据库中没有发现同源基因。Shrestha等亦曾利用高通量测序技术长度长的特点，使用Shine-Dalgarno (SD) 14片段锚定细菌mRNA 转录本上的SD 序列来纯化细菌mRNA，第一次完成了对水稻土中细菌宏转录组的报道。研究发现了在水稻土土壤细菌群落的代谢包括了好氧的和厌氧的代谢途径，α-和β-变形菌纲是主要的需氧细菌群落，好氧条件下能检测到β-氧化基因的表达，因此推测长链脂肪的β-氧化为好养群落主要的碳代谢途径；在70天的淹水培养中，群落结构变为以δ-和γ-变形菌纲为主的细菌群落结构，水稻土中的δ-变形菌纲细菌产生了与异化铁还原相关的基因。
虽然SD 序列的出现与细菌种类有关（大多数情况下出现在变形菌门），致使细菌宏转录组的研究中并不能很好的反映全部的功能多样性。但是，相比较先前基于微阵列芯片研究土壤宏转录组的方法，高通量测序具有直接了解RNA水平基因表达量和无需预先假定基因类型的优点，可以更为直接的研究土壤中微生物功能多样性。

2.3 土壤微生物遗传多样性的研究
土壤微生物群落与其他环境微生物群落相比，有更高的物种丰富度和更复杂的微生物群落基因组成。但宏基因组高通量测序法的出现，使得大规模客观揭示土壤微生物遗传多样性成为可能。
传统克隆文库研究法，其结果仅针对于完整基因片段的克隆表达，并不能全面反映土壤宏基因组的信息。但是，土壤微生物宏基因组的高通量测序，可以更全面地探究土壤宏基因组，不仅可以了解土壤微生物已知基因的遗传多样性，同时也可预测土壤微生物遗传多样性中的未知基因。通过高通量测序对环境样品DNA的直接测序可以获得有关于样品的生化代谢通路，如Mackelprang等研究了阿拉斯加冰冻冻土土芯的微生物宏基因组，除了绘制出复杂土壤宏基因组中第一个全新的产甲烷细菌基因组草图之外，还发现了冻土微生物中很多碳氮循环的相关基因随着冻土的解冻发生迅速的转变，其中硝酸还原酶Ⅰ的基因随冻土的解冻显著增加。但目前，在土壤微生物宏基因组的研究中使用的还比较少。此外，宏基因组的高通量测序结果结合相关软件分析可预测蛋白编码基因，这将为探究土壤微生物中的未知基因提供指引。如Kelley等使用Glimmer-MG软件分析人类肠道微生物宏基因组，其预测蛋白编码基因的灵敏度和准确度分别达到73.2%和54.7%。

3. 展望
高通量测序技术的发展在土壤微生物研究中有两大应用意义：第一，极大的降低了基因测序成本，实现了大规模土壤微生物基因直接测序；第二，极大的提高了测序通量，丰富了实验研究的信息量，使得研究者更为深入地研究土壤微生物。因此，高通量测序技术促进了土壤微生物物种多样性、结构多样性、功能多样性和遗传多样性研究的迅猛发展。然而，高通量测序技术的应用仍存以下方面的问题。
（1）海量数据分析难的问题。有研究估计，测序信息的存储需求每12到18个月就能增长10倍，这种核苷酸序列的爆炸式增速已远超摩尔定律的增长速率。这种海量数据使得生物信息学分析面临挑战，加大了土壤学或微生物学研究者对土壤微生物高通量测序结果分析的难度。
（2）数据去伪存真难的问题。在土壤微生物遗传多样性宏基因组高通量测序的研究中，存在基因和物种丰度被高估的情况。对高通量测序数据去伪存真除杂的过程中，运用和探寻新的统计学方法成为研究中的难题。
综上，虽然应用高通量测序技术过程中存在一些问题，但是成本低、通量高和信息丰富等特点，使其在土壤微生物研究中的应用具有优越性。在未来的研究中，笔者认为高通量测序技术在土壤微生物中的运用会越来越普遍，而其存在的问题将会促进未来研究转向土壤微生物学与统计学、生物信息学和计算机学这些基础学科交叉结合的研究之中。